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Retour aux Revues » International Journal of Nanomedicine » Volume 17

Auteurs Zhou J, Xiang H, Huang J, Zhong Y, Zhu X, Xu J, Lu Q, Gao B, Zhang H, Yang R, Luo Y, Yan F

Reçu le 28 février 2022

Accepté pour publication le 27 novembre 2022

Publié le 5 décembre 2022 Volume 2022:17 Pages 5933—5946

DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S364381

Vérifié pour plagiat Oui

Examen par Examen par un pair anonyme unique

Editeur ayant approuvé la publication : Dr Ebrahim Mostafavi

Jie Zhou,1,2 Hongjin Xiang,1,2 Jianbo Huang,1,2 Yi Zhong,3 Xiaoxia Zhu,1,2 Jinshun Xu,1,2 Qiang Lu,1,2 Binyang Gao,1,2 Huan Zhang,1 ,2 Rui Yang,1,2 Yan Luo,1,2 Feng Yan1,2 1Département d'échographie, Hôpital de Chine occidentale de l'Université du Sichuan, Chengdu, République populaire de Chine ;2Laboratoire d'imagerie par ultrasons, West China Hospital de l'Université du Sichuan, Chengdu, République populaire de Chine ;3Laboratory of Mitochondria and Metabolism, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, République populaire de Chine Correspondance : Feng Yan, Laboratory of Ultrasound Imaging, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, République populaire de Chine, Tél/Fax +86 028 8516 4146, Email [email protected] Yan Luo, Ultrasound Department, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu, République populaire de Chine, Tel/Fax +86 028 8542 3192, Email [email protected] Objectif : préparer des agents de contraste ultrasonores à l'échelle nanométrique ( Nano-UCA) et examinent le rôle de leur charge de surface dans l'activation et la phagocytose du complément.Matériels et méthodes : Nous avons analysé les protéines sériques présentes dans la couronne formée sur les nano-UCA et évalué deux marqueurs protéiques importants de l'activation du complément (C3 et SC5b-9).L'effet de la charge de surface sur la phagocytose a été évalué plus en détail à l'aide de macrophages THP-1.Résultats : lorsque les nano-UCA ont été incubées avec du sérum humain, elles ont été opsonisées par diverses protéines sanguines, en particulier C3.Les nano-UCA fortement chargés, qu'ils soient positifs ou négatifs, ont été favorablement opsonisés par les protéines du complément et phagocytés par les macrophages.Conclusion : Les nano-UCA chargés montrent une tendance plus élevée au système du complément activé et sont efficacement engloutis par les macrophages.Les présents résultats fournissent des informations significatives sur le rôle de la charge de surface des nanoparticules dans l'activation du système immunitaire inné, ce qui est important non seulement pour la conception de Nano-UCA ciblés, mais également pour l'efficacité et la sécurité d'autres agents théranostiques.Graphical Abstract : Mots-clés : agents de contraste ultrasonores à l'échelle nanométrique, charge de surface, couronne protéique, activation du complément, opsonisation, phagocytose

Les agents de contraste ultrasonores (UCA) sont généralement des microbulles remplies de gaz (MB) d'un diamètre de 1 à 8 μm, qui peuvent osciller lors de l'interaction avec l'onde ultrasonore, améliorant ainsi le signal ultrasonore réfléchi, et sont utilisés en imagerie clinique depuis des décennies. 1–3 Les MB traditionnels sont suffisamment petits pour circuler librement dans les capillaires, mais trop gros pour s'extravaser des vaisseaux sanguins afin de délivrer des médicaments aux tissus.Ces dernières années, les agents de contraste ultrasonores à l'échelle nanométrique (Nano-UCA) sont devenus un système efficace d'administration de médicaments pour l'imagerie moléculaire et la thérapie ciblée, en raison de leurs propriétés de réponse aux stimuli externes.4,5 Avec une taille de centaines de nanomètres, les Nano-UCA Les UCA peuvent s'extravaser des vaisseaux sanguins et s'accumuler dans le tissu tumoral via l'effet de perméabilité et de rétention amélioré.6 La plupart des nano-UCA ont un noyau de perfluorocarbone liquide et une enveloppe de phospholipides, capables de subir une transition de phase liquide à gazeuse.7,8 Nano-UCA Les UCA ont de nombreuses utilisations potentielles, couvrant un large éventail de recherches biomédicales qui peuvent être traduites dans de futures applications théranostiques, telles que l'imagerie moléculaire,9,10 la thérapie guidée par l'image,11 les médicaments par ultrasons et la délivrance de gènes,12,13 immunothérapie,14,15 et biocapteurs.16 De nombreuses conceptions d'UCA ont été développées, notamment des liposomes échogènes,17 des nanogouttelettes ou des nanoémulsions,18 des micelles,19 et des nanobulles remplies de gaz.20 La composition chimiqueLa position de ces nanoparticules peut être affinée en fonction des propriétés physico-chimiques et biologiques du composé actif et de leur application visée.L'enveloppe externe des nano-UCA est généralement composée de différentes molécules anioniques, cationiques et neutres (phospholipides, polymères, tensioactifs, etc.).Les UCA anioniques sont généralement utilisés pour délivrer des médicaments anticancéreux (par exemple, la doxorubicine, le paclitaxel, etc.). stabilité des nanoparticules (NPs) in vitro mais aussi pour leur demi-vie sanguine in vivo.La charge de surface des NP est généralement caractérisée par le potentiel zêta, qui est présenté par toute particule en suspension, ainsi que par les macromolécules et les surfaces des matériaux.24 La mesure du potentiel zêta est une technique standard pour évaluer la charge de surface des NP et prédire leur stabilité in vitro.25 Cependant, peu d'études ont rapporté le rôle de la charge de surface ou du potentiel zêta des NP dans le système immunitaire inné.

Le système immunitaire inné, y compris le réseau du complément et le système phagocytaire mononucléaire (MPS), est la première ligne de défense contre l'invasion par des virus, des bactéries, ainsi que des substances étrangères telles que des micro et nanoparticules.26 Après administration intraveineuse, les NP sont rapidement recouverte par des protéines sanguines (opsonines) pour former une « couronne protéique », dans un processus appelé opsonisation.Ce processus aide les cellules immunitaires à reconnaître les NP.La protéine du complément 3 (C3) est au cœur de la réaction enzymatique du complément, qui implique toutes les voies d'activation du complément.Lors de l'activation, C3 produit des opsonines importantes, telles que C3b et ses fragments (iC3b et C3dg).27 Les phagocytes (neutrophiles ou macrophages) peuvent reconnaître les NP marquées avec des opsonines via leurs récepteurs à la surface des cellules et les éliminer de la circulation sanguine.28

La composition de la couronne protéique dépend de la surface et des propriétés physicochimiques des NP.29 Des études antérieures ont évalué les interactions des protéines plasmatiques ou sériques avec diverses NP, par exemple, des nanotubes de carbone,30,31 des micelles,32 des liposomes,33 des nanosphères polymères. , 34, 35 oxyde de fer, 36 et NPs d'or. 37 À notre connaissance, aucune étude systématique de l'opsonisation et de l'activation du système du complément induites par les UCA (microbulles, nanoémulsions ou nanogouttelettes) n'a été publiée.L'enveloppe des UCA est généralement composée d'une monocouche mince et souple de phospholipides et de polymères dérivés de lipides.38,39 Le noyau gazeux ou liquide confère aux UCA une fluidité et une déformabilité élevées, ce qui les rend très différents des autres types de NP avec peu ou pas déformabilité.

L'identification des matériaux utilisés pour préparer les nano-UCA et la compréhension de leur interaction avec le système immunitaire sont la clé de leur traduction clinique réussie.Il est bien connu que la taille, la forme, l'hydrophobicité et le revêtement de polyéthylène glycol (PEG) des NP sont des facteurs importants qui affectent leurs interactions avec le système immunitaire.40–42 Cependant, on sait peu de choses sur le rôle de la charge de surface des nanoparticules. -UCAs dans ces interactions.Dans cette étude, nous avons étudié le rôle de la charge de surface des nano-UCA dans l'opsonisation, l'activation du complément et la phagocytose.Le processus d'activation du complément a été évalué en identifiant la composition de la couronne protéique des nano-UCA et en quantifiant la production de C3 activé et du complexe terminal du complément SC5b-9.L'interaction des nano-UCA avec les cellules immunitaires a été étudiée en observant la phagocytose des NP à l'aide de macrophages THP-1 activés.Les résultats de la présente étude devraient fournir des informations utiles pour comprendre le rôle des agents de contraste ultrasonores à l'échelle nanométrique dans la réponse immunitaire.

Tous les participants ont donné leur consentement éclairé et l'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital de Chine occidentale de l'Université du Sichuan (n° 2021889).L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki.Des échantillons de sang total de la veine cubitale médiane ont été prélevés sur des donneurs de sang sains au Département d'imagerie par ultrasons, West China Hospital, Université du Sichuan.Les échantillons ont été coagulés à température ambiante pendant 2 h puis centrifugés à 2000 g pendant 20 min pour séparer le sérum.

Le phospholipide neutre 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC, S01004 AVT Pharmaceutical Co., Ltd, Shanghai, Chine) a été utilisé comme composant principal de la coque des Nano-UCA.Pour préparer des nano-UCA neutres (Neu), une quantité de 5 % molaire de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy (polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-mPEG2000, F01008 AVT Pharmaceutical Co ., Ltd) a été ajouté au DPPC pour empêcher l'agrégation in vitro et également fournir des propriétés furtives aux Nano-UCA.Pour préparer des Nano-UCA avec une coque chargée, soit le lipide chargé négativement 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phospho-l-sérine (DPPS, S04002 AVT Pharmaceutical Co., Ltd) soit le cholestéryl 3β- chargé positivement Une molécule de chlorhydrate de carbamate de N-(diméthylaminoéthyl) (DC-CHOL, O02003 AVT Pharmaceutical Co., Ltd) a ensuite été ajoutée aux nano-UCA neutres.La composition et la nomenclature des différentes formulations utilisées dans cette étude sont présentées dans le tableau 1. Les nano-UCA ont été synthétisés à l'aide d'une méthode d'hydratation en couche mince, comme décrit ci-dessous.Les matières premières requises ont été pesées et mélangées selon le % molaire du tableau 1, puis dissoutes dans du chloroforme à 5 mg/mL à l'aide d'un ballon à fond rond.Le solvant a été évaporé sous vide dans un évaporateur rotatif à 50°C jusqu'à ce qu'un film lipidique fin et homogène se soit formé et séché.Une solution saline stérile a été ajoutée au film lipidique (1 mg/mL) et le mélange a été dispersé à 50 °C à l'aide d'un nettoyeur à ultrasons (SB-3200-DTD, Scientz Biotechnology Co., Ltd, Ningbo, Chine).Cinq millilitres de la suspension obtenue ont ensuite été placés sur un bain de glace pendant 5 min et mélangés avec 1 ml de perfluorohexane (C6F14, Strem Chemicals, Inc., Newburyport, USA).Le mélange a été soniqué à l'aide d'un instrument d'oscillation à ultrasons (SCIENTZ-IID, Scientz Biotechnology Co., Ltd) pendant 5 min à 300 W et à un cycle de service de 50 % pour générer les nanoparticules.La suspension de NPs a été extrudée à travers une membrane en polycarbonate (PCTE) (taille de filtre 0,8 µm, ϕ = 19,05 mm, 100/PK, SterliTech CO, Washington, USA) à l'aide d'une extrudeuse manuelle (Genizer LLC, Californie, USA).La suspension résultante de Nano-UCA a été stockée à 4 ℃ jusqu'à son utilisation.Des images de microscopie électronique à transmission (TEM) ont été obtenues pour inspecter la forme des nano-UCA (microscope électronique Tecnai G2 F20 S-TWIN, FEI, Inc., Hillsboro, États-Unis).La taille et le potentiel zêta des NP ont été mesurés à l'aide d'un analyseur PALS NanoBrook 90plus (Brookhaven, Inc., New York, États-Unis).La concentration de NP a été mesurée par un instrument ZetaView (Particle Metrix, Kassel, Allemagne) puis ajustée à 1 × 1012 ou 1 × 1010 particules / ml pour les expériences ultérieures.Tableau 1 La composition et la nomenclature des nano-UCA avec différentes charges de surface

Tableau 1 La composition et la nomenclature des nano-UCA avec différentes charges de surface

Le système de dosage est basé sur les méthodes de Chen F et Vu Vivian P.36,43 Une concentration de 1 × 1012 particules/mL de Neu Nano-UCA dans une solution saline a été mélangée avec des échantillons de sérum provenant de trois donneurs de sang dans un rapport de volume de 1:3 (v/v).A la fin de l'incubation (37 ℃, 1 h), les nanoparticules ont été récupérées et lavées trois fois par centrifugation à 100 000 g dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) additionnée de Ca2+/Mg2+ pendant 5 min à l'aide d'une ultracentrifugeuse Beckman Optima TLX.Les culots déposés dans le sérum ont été lavés avec 100 µL de dodécylsulfate de sodium (SDS) 2% pendant 1h à température ambiante pour extraire les protéines constituant la couronne.Le surnageant protéique a été récupéré par ultracentrifugation supplémentaire et stocké dans des aliquotes congelées à -80 ℃ jusqu'à utilisation.

Les protéines adsorbées récupérées à la surface des Neu Nano-UCA ont été mélangées avec un tampon de chargement d'échantillon non réducteur (P0016N, Native Gel Sample Loading Buffer, 5X, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) et chargées (20 μL par voie) sur 4 % empilement de gels de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide.L'électrophorèse a ensuite été réalisée (70 V pendant 20 min) ;les bandes de gel résultantes de protéines entières ont été soigneusement coupées à l'aide d'une lame chirurgicale jetable.À l'intérieur des bandes de gel, les protéines ont été déshydratées à l'aide d'acétonitrile (ACN), réduites, alkylées avec du dithiothréitol et de l'iodoacétamide, puis digérées en peptides à l'aide de trypsine.Les peptides (8 μg) ont été resolubilisés dans de l'acide formique (FA) à 0,1 % et analysés à l'aide d'un EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, États-Unis) avec un système de spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo) en data- mode d'acquisition dépendante (DDA).La colonne de séparation (75 μm × 15 cm, colonne C18 remplie de particules de 3,0 μm C18) a été utilisée avec un débit de 300 nL/min en utilisant 0,1 % FA (solvant A) et 80 % ACN plus 0,1 % FA (solvant B) avec un gradient de 78 min.Le gradient de séparation LC était de 5 à 8 % de solvant B pendant 8 min, de 8 à 22 % de solvant B pendant 50 min, de 22 à 32 % de solvant B pendant 12 min, de 32 à 90 % de solvant B pendant 1 min et de 90 % de solvant B pendant les 7 dernières minutes.Les paramètres de la source d'ions, y compris la tension de pulvérisation, le gaz de balayage et la température du tube de transfert d'ions, ont été obtenus à partir des paramètres de réglage et ajustés pour les états actuels de l'instrument.Pour les scans MS1, la masse variait de m/z 350 à 1550 avec une résolution de 60 000 (à m/z 200), une valeur cible de contrôle automatique de gain (AGC) était de 1 × 106, un temps d'injection maximal était de 50 ms, les ions précurseurs d'intensité la plus élevée étaient pour l'analyse MS2 en 3 secondes, l'abondance minimale d'ions précurseurs est de 50 000 et l'isolat de la fenêtre est de 2. Pour l'analyse MS2, l'énergie de collision HCD normalisée était de 35 %, la résolution était de 15 000 (à m /z 200), la valeur cible AGC a été fixée à 5 × 104 et le temps d'injection maximal était de 80 ms.La lentille RF était de 30 % et les spectres ont été collectés en mode profil (MS1) et en mode centroïde (MS2).Des analyses qualitatives et quantitatives des spectres MS ont été réalisées à l'aide du logiciel Maxquant et de la plateforme « Wu Kong » (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

Afin d'étudier la liaison du C3 activé aux Nano-UCA avec différentes charges de surface, 1 × 1012 particules/mL de Nano-UCA neutres et chargés ont été mélangés avec des échantillons de sérum humain dans un rapport de 1:3 (v/v) pour préparer le surnageant protéique.Pour chaque échantillon, des aliquotes de 20 μL ont été mélangées avec un tampon de chargement d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécylsulfate de sodium non réducteur (SDS-PAGE) et bouillies pendant 5 min.Les protéines bouillies ont été séparées par électrophorèse par un gel Tris-Gly 8% et transférées sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF).La membrane a été bloquée à l'aide de lait en poudre écrémé à 5 % (p/p) dans 1 × PBS avec 0,1 % de Tween-20 (PBS-T) pendant 1 h à température ambiante et sondée avec les anticorps primaires correspondants (anticorps monoclonal de souris dirigé contre facteur de complément humain activé C3, I3/15 sc-47687, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, États-Unis) à 4 ℃ pendant la nuit, suivi d'un lavage de la membrane trois fois avec une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,05 % de Tween-20 (TBS- T).Enfin, les échantillons résultants ont été incubés pendant 1 h avec les anticorps secondaires correspondants contre l'espèce d'anticorps primaire (Mouse IgGκ light chain binding protein conjugated to horseradish peroxydase (HRP), sc-516102, Santa Cruz).Les signaux des bandes protéiques sur la membrane PVDF ont été visualisés à l'aide d'un imageur à chimiluminescence (ChemiDoc™ MP, Bio-Rad System, Inc., Hercules, USA).

Avant et après l'incubation avec les Nano-UCA, le sérum a été analysé pour déterminer les niveaux de SC5b-9 à l'aide d'un kit ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) (MicroVue SC5b-9 Plus EIA, Quidel Corporation, San Diego, USA).Pour quantifier les niveaux de SC5b-9, nous avons utilisé les normes de la série SC5b-9 avec des concentrations de 10, 40, 110 et 170 ng/mL, selon les instructions du fabricant.Les étalons et les échantillons ont été ajoutés aux puits de microdosage pré-revêtus d'anticorps monoclonal spécifique anti-SC5b-9.Après 1 h d'incubation, un cycle de lavage a été effectué pour éliminer les matériaux non liés.Des anticorps conjugués à la HRP dirigés contre des antigènes sur SC5b-9 ont été ajoutés à chaque puits.L'incubation avec des anticorps conjugués à la HRP pendant 30 minutes a ensuite été suivie d'un autre cycle de lavage.Enfin, un substrat enzymatique chromogénique a été ajouté à chaque puits.Après réaction avec les anticorps conjugués à la HRP liés, le substrat est devenu bleu.Un réactif a ensuite été ajouté pour arrêter le développement de la couleur, ce qui a donné une couleur jaune.Les valeurs d'absorbance de l'étalon et de l'échantillon (A450) ont été mesurées par un lecteur de microplaques (Synergy HT, Bio-Tek, Vermont USA).L'analyse quantitative des échantillons a été effectuée en interpolant les résultats A450 en utilisant l'équation de régression linéaire de la courbe standard.

Des cellules humaines pro-monocytaires THP-1 (CC1904, CellCook Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chine) et des cellules humaines de cancer du poumon non à petites cellules NCI-H1299 (CC0203, CellCook Biotechnology Co., Ltd.) ont été cultivées en routine dans Milieu RPMI 1640 (22 400–089, Gibco, Karlsruhe, Allemagne), contenant 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (10 100–147, Gibco) complété par 10 000 unités/mL de pénicilline et 10 000 unités/mL de streptomycine ( 15, 140-122, Gibco).Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humidifiée de 95% d'air et 5% de CO2.

Pour évaluer l'absorption des Nano-UCA par les macrophages, des cellules THP-1 ont été ensemencées dans des plaques 6 puits de 35 mm à une densité de 1 × 106 cellules/puits en présence de 100 nM d'acétate de myristate de phorbol (PMA, P1585, Sigma, St Louis, USA) et laisser attacher aux plaques pendant 48 h.Après addition de PMA, les cellules THP-1 différenciées ont été incubées avec 1 × 1010 particules/mL de Nano-UCA marqués au perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthyl-indocarbocyanine (DiI) (C1036 , Beyotime Biotechnology) à température ambiante pendant 1 h.Après coloration par fluorescence lysosomale (C1046, Lyso-tracker red, Beyotime Biotechnology) et fluorescence du noyau (C1022, Hoechst 33,342 blue, Beyotime Biotechnology), les cellules ont été fixées et visualisées par la microscopie confocale à fluorescence laser (LCFM, A1R-MP, Nikon, Tokyo , Japon).Pour l'analyse quantitative, après incubation avec des Nano-UCA marqués au DiI, les cellules THP-1 ont été détachées avec de la trypsine EDTA, collectées et analysées à l'aide d'un cytomètre en flux (FACS Caliburl, BD Biosciences, Franklin Lake, USA).Les Nano-UCA marqués ont également été incubés avec des cellules NCI-H1299 non phagocytaires et observés à l'aide de LCFM, comme décrit ci-dessus.

Les données ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, CA, USA).Les différences ont été évaluées à l'aide de l'analyse de variance unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Newman-Keuls pour les comparaisons de plusieurs groupes et du test t de Student pour les comparaisons entre deux groupes.Toutes les données quantitatives présentées dans les figures sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD).

Dans cette étude, nous avons préparé sept formulations de Nano-UCA.En particulier, des nano-UCA chargés positivement et négativement ont été préparés en ajoutant différents rapports molaires de molécules anioniques ou cationiques aux échantillons Neu Nano-UCA (tableau 1);la synthèse est illustrée sur la figure 1A.Afin d'évaluer le rôle de la charge de surface dans l'activation du complément, la taille des particules et la distribution correspondante ont été maintenues aussi constantes que possible pour toutes les formulations.Les images TEM de la figure 1B montrent que les particules Nano-UCA étaient presque sphériques et avaient une taille d'environ 500 à 600 nm, avec une surface douce et lisse.La taille des particules, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta de différentes formulations de Nano-UCA sont illustrés aux figures 1C à E, respectivement.La seule différence significative entre les différentes nanoparticules est la variation du potentiel zêta.Pour les Neu Nano-UCA formulés avec 95 % de DPPC + 5 % de DSPE-mPEG2000, le potentiel zêta était de -0,32 ± 1,95 mV.Lorsque le phospholipide anionique DPPS a été ajouté à la formulation neutre, le potentiel zêta a diminué progressivement de −0,32 ± 1,95 mV (0 %) à −11,29 ± 2,01 mV (25 %), −22,85 ± 10,81 mV (50 %) et − 40,95 ± 1,16 mV (75 %).En revanche, les potentiels zêta des formulations contenant 0 %, 25 %, 50 % et 75 % de DC-CHOL ont augmenté progressivement de -0,32 ± 1,95 mV à 15,80 ± 3,18 mV, 29,16 ± 7,78 mV et 51,33 ± 2,89 mV, respectivement.Lorsqu'ils sont stockés dans une solution saline à 4 ℃, tous les Nano-UCA sont restés relativement stables pendant la période de test (Figure 2).Figure 1 Synthèse et caractérisation de différentes formulations de Nano-UCA.(A) Représentation schématique des Nano-UCA avec diverses charges de surface.Des nano-UCA avec des charges de surface neutres, positives et négatives ont été préparées avec différents rapports molaires de DPPC (boule bleue), DC-CHOL (boule rose) et DPPS (boule verte).DSPE-mPEG2000 (5 % en moles, bille violette) a été ajouté à toutes les formulations pour empêcher l'agrégation des particules.(B) Images de microscopie électronique à transmission de Nano-UCA avec différentes charges de surface.(C) Taille moyenne des particules (nm), (D) indice de polydispersité moyen (PDI) et (E) potentiel zêta moyen (mV) de différentes formulations de Nano-UCA.Figure 2 Stabilité in vitro des nano-UCA.(A) Taille moyenne des particules (nm), (B) indice de polydispersité moyen (PDI) et (C) potentiel zêta moyen (mV) de différentes formulations en solution saline à 1, 2, 4, 7 et 14 jours.Chaque point représente la moyenne ± SD de trois répétitions.

Figure 1 Synthèse et caractérisation de différentes formulations de Nano-UCA.(A) Représentation schématique des Nano-UCA avec diverses charges de surface.Des nano-UCA avec des charges de surface neutres, positives et négatives ont été préparées avec différents rapports molaires de DPPC (boule bleue), DC-CHOL (boule rose) et DPPS (boule verte).DSPE-mPEG2000 (5 % en moles, bille violette) a été ajouté à toutes les formulations pour empêcher l'agrégation des particules.(B) Images de microscopie électronique à transmission de Nano-UCA avec différentes charges de surface.(C) Taille moyenne des particules (nm), (D) indice de polydispersité moyen (PDI) et (E) potentiel zêta moyen (mV) de différentes formulations de Nano-UCA.

Figure 2 Stabilité in vitro des nano-UCA.(A) Taille moyenne des particules (nm), (B) indice de polydispersité moyen (PDI) et (C) potentiel zêta moyen (mV) de différentes formulations en solution saline à 1, 2, 4, 7 et 14 jours.Chaque point représente la moyenne ± SD de trois répétitions.

Pour étudier la composition de la couronne protéique recouvrant les Neu Nano-UCA, nous avons effectué une analyse MS des protéines sériques liées aux Nano-UCA (figure 3A et tableau supplémentaire 1).C3 figurait parmi les protéines les plus abondantes dans les trois échantillons de sérum testés.Pour étudier plus avant l'influence de la charge de surface sur l'opsonisation, le C3 activé dans la couronne protéique a été déterminé à l'aide de l'analyse Western blot (WB).La figure 3B suggère que le C3 activé était lié à un cluster de protéines plutôt qu'à la surface du Nano-UCA seul : le C3 activé élué de tous les Nano-UCA chargés en surface a montré un motif de poids moléculaire élevé (≥ 270 kDa), comparé à celui de C3 purifié avec un poids moléculaire de 195 kDa.L'expérience a été répétée trois fois en utilisant trois échantillons de sérum différents.Sur la base de la densité intégrée (ID) calculée à partir de la valeur grise (points par pouce, Figure 3C) de la bande C3 WB activée par le logiciel ImageJ (version 1.51j8, National Institutes of Health, USA), les Nano-UCA neutres ont adsorbé le quantité la plus faible de C3 activé (836,45 ± 320,34 ID).Les Nano-UCA avec une charge inférieure ont lié une quantité relativement faible de C3 activé, avec 3490,56 ± 1450,29 ID et 1481,39 ± 40,59 ID pour les Nano-UCA à 25 % chargés négativement et à 25 % chargés positivement, respectivement.Les Nano-UCA à 50 % (-) et 50 % (+) ont adsorbé une plus grande quantité de C3 activé que les échantillons à charge inférieure, avec respectivement 6072,28 ± 1049,22 ID et 4145,03 ± 286,69 ID pour les Nano-UCA chargés négativement et positivement. .Les Nano-UCA à haute charge ont adsorbé la plus grande quantité de C3 activé, avec 19 448,67 ± 522,58 ID et 18 775,48 ± 1950,21 ID pour 75 % (-) et 75 % (+) Nano-UCA, respectivement.Figure 3 Rôle de la charge de surface des agents de contraste ultrasonores à l'échelle nanométrique dans l'activation du système du complément et de la phagocytose.(A) Couronne protéique formée sur les Neu Nano-UCA : carte thermique des 30 principales protéines identifiées dans les couronnes.Les protéines sont classées selon le logarithme du score de confiance déterminé à partir du nombre de peptides et de la qualité des spectres MS.(B) Bandes non réductrices Western blot de C3 activé liées à des surfaces Nano-UCA chargées différemment dans des échantillons de sérum.L'expérience a été répétée trois fois en utilisant trois échantillons de sérum différents.(C) Analyse des valeurs de gris des bandes WB de C3 activé.L'expérience a été répétée trois fois en utilisant trois échantillons de sérum différents.Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (*** P < 0,001).(D) Dosage immuno-enzymatique pour la détection quantitative de SC5b-9 humain.Le graphique dans le coin supérieur droit montre la courbe standard de SC5b-9, et l'histogramme en dessous montre la quantité de SC5b-9 produite dans des échantillons de sérum incubés avec des Nano-UCA chargés différemment.La colonne de contrôle affiche les niveaux de SC5b-9 dans le sérum avant l'incubation avec les Nano-UCA.Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD de trois expériences répétées.(E) Effets de la charge de surface (potentiel zêta, mV) sur les niveaux de C3 activé (déterminé par analyse Western blot, bleu) et SC5b-9 (déterminé par ELISA, rouge) dans le sérum après incubation avec des Nano-UCA.Pour une formulation de Nano-UCA donnée, chaque paire de données de la figure représente une mesure individuelle.

Figure 3 Rôle de la charge de surface des agents de contraste ultrasonores à l'échelle nanométrique dans l'activation du système du complément et de la phagocytose.(A) Couronne protéique formée sur les Neu Nano-UCA : carte thermique des 30 principales protéines identifiées dans les couronnes.Les protéines sont classées selon le logarithme du score de confiance déterminé à partir du nombre de peptides et de la qualité des spectres MS.(B) Bandes non réductrices Western blot de C3 activé liées à des surfaces Nano-UCA chargées différemment dans des échantillons de sérum.L'expérience a été répétée trois fois en utilisant trois échantillons de sérum différents.(C) Analyse des valeurs de gris des bandes WB de C3 activé.L'expérience a été répétée trois fois en utilisant trois échantillons de sérum différents.Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD (*** P < 0,001).(D) Dosage immuno-enzymatique pour la détection quantitative de SC5b-9 humain.Le graphique dans le coin supérieur droit montre la courbe standard de SC5b-9, et l'histogramme en dessous montre la quantité de SC5b-9 produite dans des échantillons de sérum incubés avec des Nano-UCA chargés différemment.La colonne de contrôle affiche les niveaux de SC5b-9 dans le sérum avant l'incubation avec les Nano-UCA.Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD de trois expériences répétées.(E) Effets de la charge de surface (potentiel zêta, mV) sur les niveaux de C3 activé (déterminé par analyse Western blot, bleu) et SC5b-9 (déterminé par ELISA, rouge) dans le sérum après incubation avec des Nano-UCA.Pour une formulation de Nano-UCA donnée, chaque paire de données de la figure représente une mesure individuelle.

Les niveaux sériques de SC5b-9 ont été mesurés pour évaluer l'effet des Nano-UCA sur l'activation du complément.Pour déterminer la concentration de SC5b-9, une courbe standard a été obtenue en utilisant les échantillons standard fournis avec le kit SC5b-9 Plus EIA.La pente, l'ordonnée à l'origine et le coefficient de corrélation de la ligne de meilleur ajustement se situent dans les plages spécifiées par le fabricant (y = 0,007466x + 0,2036, r = 0,997).La figure 3D révèle qu'une charge de surface accrue a conduit à une production accrue de SC5b-9 dans le sérum.Par exemple, la quantité de SC5b-9 produite par les Neu Nano-UCA était de 19,84 ± 4,70 µg/mL, tandis que les Nano-UCA à 25 % (-) et 25 % (+) produisaient des niveaux de SC5b-9 de 30,41 ± 25,69 et 23,27 ±8,82 µg/mL, respectivement.Pour les Nano-UCA 50 % (-) et 50 % (+), les quantités produites de SC5b-9 étaient respectivement de 99,85 ± 32,70 et 47,87 ± 1,52 µg/mL.Semblable au C3 activé lié aux nano-UCA, 75 % (-) et 75 % (+) des nano-UCA ont produit les quantités les plus élevées de complexe SC5b-9 : 152,65 ± 3,65 et 78,64 ± 27,93 µg/mL, respectivement.Ces résultats indiquent une corrélation significative entre activé C3, SC5b-9 et la charge de surface des Nano-UCA (Figure 3E), suggérant que l'activation du système du complément par les Nano-UCA dépend de leur charge de surface.

Pour examiner plus en détail si les Nano-UCA étaient simplement adsorbés à la surface des cellules ou engloutis par des macrophages, les cellules THP-1 et NCI-H1299 ont été incubées séparément avec des Nano-UCA marqués au DiI.Après un lavage vigoureux des cellules, presque tous les Nano-UCA ont disparu du milieu de culture, alors qu'ils étaient encore observés dans les cellules THP-1 (Figure 4).L'imagerie LCFM a révélé que les nano-UCA étaient localisés dans des lysosomes verts marqués par fluorescence (figure 4).Les figures 5A à D montrent l'absorption de nano-UCA chargés différemment par les cellules THP-1.Tous les Nano-UCA chargés présentaient une forte fluorescence rouge à l'intérieur des cellules THP-1 (figure 5A).L'analyse de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) (Figure 5B) a indiqué que l'absorption des Nano-UCA par les cellules THP-1 augmentait de manière significative avec l'augmentation de la densité de charge de surface, en particulier pour les Nano-UCA avec une charge positive de 75 %.Les valeurs MFI de 25 % (-), 50 % (-) et 75 % (-) des Nano-UCA étaient respectivement 10,6, 11,5 et 11,9 fois supérieures à celles des Neu Nano-UCA.De plus, les valeurs MFI de 25 % (+), 50 % (+) et 75 % (+) des Nano-UCA étaient respectivement 9,0, 9,9 et 28,5 fois supérieures à celles des Neu Nano-UCA.Des résultats quantitatifs similaires ont été obtenus par cytométrie en flux (figures 5C et D).Figure 4 Microscopie confocale à balayage laser de la phagocytose des Neu Nano-UCA par les macrophages THP-1.Dans cette expérience, les nanoparticules ont d'abord été incubées avec du sérum de donneur pour produire la couronne protéique, puis incubées avec des cellules.Des cellules NCI-H1299 non phagocytaires ont également été incubées avec le même sérum de donneur et utilisées à des fins de comparaison.Des Neu Nano-UCA marqués au DiI (rouges) ont été observés dans les cellules THP-1 après un lavage intensif avec du PBS, mais n'ont pas été détectés dans les cellules NCI-H1299.Figure 5 Phagocytose des nano-UCA avec différentes charges de surface par les cellules THP-1.(A) Images de microscopie confocale à balayage laser de l'absorption cellulaire des nano-UCA après incubation sérique pour générer une couronne de protéines.Les lysosomes des cellules THP-1, des noyaux cellulaires et des nano-UCA ont été marqués avec un colorant fluorescent vert, bleu et rouge, respectivement.Tous les Nano-UCA ont été incubés avec des cellules THP-1 pendant 1 h.Barre d'échelle = 10 mm.(B) Quantification de l'absorption cellulaire basée sur les valeurs MFI de chaque cellule obtenues à partir de la microscopie confocale à balayage laser.(C) Absorption cellulaire des nano-UCA déterminée par cytométrie en flux.(D) Absorption cellulaire quantitative de Nano-UCA avec différentes charges de surface, obtenue par cytométrie en flux.

Figure 4 Microscopie confocale à balayage laser de la phagocytose des Neu Nano-UCA par les macrophages THP-1.Dans cette expérience, les nanoparticules ont d'abord été incubées avec du sérum de donneur pour produire la couronne protéique, puis incubées avec des cellules.Des cellules NCI-H1299 non phagocytaires ont également été incubées avec le même sérum de donneur et utilisées à des fins de comparaison.Des Neu Nano-UCA marqués au DiI (rouges) ont été observés dans les cellules THP-1 après un lavage intensif avec du PBS, mais n'ont pas été détectés dans les cellules NCI-H1299.

Figure 5 Phagocytose des nano-UCA avec différentes charges de surface par les cellules THP-1.(A) Images de microscopie confocale à balayage laser de l'absorption cellulaire des nano-UCA après incubation sérique pour générer une couronne de protéines.Les lysosomes des cellules THP-1, des noyaux cellulaires et des nano-UCA ont été marqués avec un colorant fluorescent vert, bleu et rouge, respectivement.Tous les Nano-UCA ont été incubés avec des cellules THP-1 pendant 1 h.Barre d'échelle = 10 mm.(B) Quantification de l'absorption cellulaire basée sur les valeurs MFI de chaque cellule obtenues à partir de la microscopie confocale à balayage laser.(C) Absorption cellulaire des nano-UCA déterminée par cytométrie en flux.(D) Absorption cellulaire quantitative de Nano-UCA avec différentes charges de surface, obtenue par cytométrie en flux.

Les NP ont un grand potentiel d'application en nanomédecine, cependant, leur capacité à cibler les tissus malades est encore largement inconnue, avec seulement 0,7 % (médiane) de la dose de NP administrée aux tumeurs solides.44 L'une des causes directes de cette faible efficacité est que les NP sont rapidement éliminées par le système immunitaire inné.45,46

L'opsonisation des protéines sanguines et l'absorption par le MPS ont été suggérées comme étant les principaux mécanismes d'élimination rapide des liposomes du sang, affectant leur durée de vie.47,48 La couche externe des liposomes est similaire à celle des MB et des Nano- Les UCA, constitués de phospholipides neutres et/ou chargés.Klapper et al ont découvert que les liposomes neutres fabriqués avec le phospholipide dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) incubés dans le plasma entraînaient la génération de produits d'activation du complément (C3a et SC5b-9).49 Van den Hoven et al ont rapporté que les liposomes vides contenant 5 % en moles de DSPE -PEG2000 n'a pas induit de manière significative l'activation du complément (C3, SC5b-9).50 Chonn et al ont mené une étude approfondie sur l'effet de la charge de surface des liposomes sur l'activation du complément.Ils ont utilisé des échantillons de sérum provenant d'humains sains ou de cobayes incubés avec des liposomes, puis ont déterminé l'activité hémolytique résiduelle du sérum comme mesure de l'activation du complément.Ils ont découvert que la charge de surface des liposomes était un facteur clé dans l'activation du complément, quel que soit le type de charge de surface.51

Le système immunitaire inné interagit non seulement avec les liposomes, mais avec toutes les nano et microparticules.Lundqvist et al ont utilisé des NP de polystyrène recouvertes de différents polymères pour effectuer une évaluation systématique des effets de la charge de surface et de la taille des NP sur la couronne protéique.29 Ils ont découvert que la taille et la charge de surface jouaient un rôle important dans la formation de la couronne. des NP.Ils ont également montré que la plupart des protéines impliquées dans la voie du complément, telles que C3 et le facteur H du complément, peuvent être adsorbées à la surface des NP neutres.Notre analyse protéomique a montré que des Neu Nano-UCA de 600 nm incubés avec du sérum humain adsorbaient plus de 30 protéines à leur surface (figure 3A et tableau supplémentaire 1).Parmi ces protéines, C3 présentait la teneur la plus élevée et était liée à d'autres protéines (formant un cluster) plutôt qu'à la surface native des nanoparticules (Figure 3B), comme également rapporté dans d'autres études. sérum et plasma humains, Chen et al ont révélé que les nanoworms étaient rapidement opsonisés par C3 via la voie alternative du système du complément.36 Ils ont également démontré que C3 se liait de manière covalente à la couronne protéique des NP plutôt qu'à la coque de dextran. utilisés dans la présente étude sont très différents de ceux considérés par Chen et al en termes de taille, de forme, de revêtement de surface et de matériau de base, leur liaison à C3 était plutôt similaire.Bien que tous nos Nano-UCA contenaient 5% en moles de DSPE-PEG2000, la PEGylation n'a empêché ni la formation de couronne protéique ni l'activation du complément.

Les microbulles SonazoidTM recouvertes de phosphatidylsérine d'œuf hydrogénée (HEPS) phospholipidique chargée à 100 % sont de préférence absorbées par les cellules de Kupffer dans le foie,52 fournissant une image de contraste spécifique au parenchyme appelée image de phase de Kupffer.53 Cependant, le mécanisme exact par lequel les microbulles SonazoidTM sont spécifiquement accumulée dans les cellules de Kupffer n'est toujours pas claire.Une seule étude antérieure a étudié le rôle de la charge de surface MB dans l'imagerie par ultrasons à contraste amélioré.54 Certains agents de microbulles adhèrent aux leucocytes activés dans les veinules postcapillaires via l'intégrine de surface cellulaire ou l'opsonisation des composants du complément, entraînant une amélioration persistante du contraste myocardique dans les zones tissulaires. inflammation.54 De plus, Fisher et al ont montré que des microbulles chargées négativement (2–3 μm) induisaient une rétention capillaire et ont suggéré que cette rétention était médiée par la fixation de C3b activé à la surface des MBs.55 Ils ont utilisé la cytométrie en flux pour analyser la complément lié à la surface des MB et a constaté que C3b se liait principalement aux MB anioniques, mais présentait une adsorption beaucoup plus faible à la surface des MB neutres contenant du stéarate de PEG-40.Notre étude suggère en outre que, quelle que soit leur charge, tous les Nano-UCA pourraient induire l'activation du complément ;une charge de surface plus élevée a conduit à des quantités plus élevées de C3 activé se liant aux NP (figure 3C) et de SC5b-9 produit dans le sérum (figure 3D).La figure 3E résume les résultats ci-dessus : la charge de surface (ou la valeur absolue du potentiel zêta) des Nano-UCA joue un rôle important dans l'opsonisation (C3 activé) et l'activation du complément (SC5b-9).

Suite à l'activation du complément, les Nano-UCA sont éliminés par les cellules immunitaires in vivo.La liaison du composant du complément C3b à la surface des NP conduit à la phagocytose, en raison de la présence de récepteurs du complément sur les cellules phagocytaires. Comme le montre la figure 3E, par rapport aux Neu Nano-UCA, les Nano-UCA chargés adsorbés ou activé les quantités les plus élevées de C3 et SC5b-9, conduisant à leur engloutissement efficace par les macrophages (figure 5A).Cette découverte peut expliquer en partie le mécanisme de l'imagerie spécifique de la phase de Kupffer des microbulles SonazoidTM.

L'opsonisation des NP est une étape clé dans l'activation du complément, la reconnaissance des phagocytes et la clairance de la circulation sanguine.La plupart des tentatives pour éviter ou réduire la liaison des opsonines se sont concentrées sur la préparation de NP furtives.Plusieurs stratégies ont été explorées, notamment l'utilisation de NP inorganiques plus petites,58 des microsphères imitant les cellules (enrobant les particules de membranes de cellules sanguines),59,60 la préparation de particules avec des biomolécules naturelles,61 le contrôle des composants protéiques corona,62 l'utilisation de vésicules cellulaires comme vecteurs de médicaments, Malheureusement, bon nombre de ces approches ignorent souvent le rôle de la charge de surface des nanoparticules dans le système immunitaire inné, malgré son importance pour la sécurité clinique et l'efficacité des nanomédicaments.

Des études récentes ont montré que la faible efficacité de ciblage des NP sur les sites tumoraux (0,7 à 2,2 %) entrave gravement leur application clinique dans le traitement du cancer.44,65 Les effets toxiques potentiels, tels que les réactions anaphylactoïdes associées aux nano-UCA chargés, constituent un autre problème important. affectant leur traduction clinique, comme cela a déjà été rapporté pour les liposomes et d'autres types de nanomédicaments.50 Ces aspects doivent être soigneusement pris en compte dans les futures conceptions de formulation.

Dans cette étude, nous avons synthétisé des Nano-UCA avec différentes charges de surface.Nos résultats montrent que la charge de surface joue un rôle important dans l'opsonisation et l'activation du complément.Les nano-UCA chargés montrent une tendance plus élevée à interagir avec C3 et à produire plus de SC5b-9 par rapport aux nano-UCA neutres.De plus, les nano-UCA chargés sont efficacement engloutis par les macrophages.Ces résultats nous permettent d'identifier la composition corona des Nano-UCA et de démontrer l'importance de la charge de surface dans l'activation et l'absorption du complément des Nano-UCA par les macrophages.

Remerciez Yi Zhong, Tao Su et Shisheng Wang (West China-Washington Mitochondria and Metabolism Research Center, West China Hospital, Sichuan University) pour l'acquisition et l'analyse relatives des données MS.

Les auteurs ne signalent aucun conflit d'intérêts dans ce travail.

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